Thermo Scientific™ Active Ras Pull-Down and Detection Kit

Die Active GTPase Pull-Down and Detection Kits messen die Aktivierung von kleinen GTPasen durch Isolierung mittels spezifischer nachgeschalteter Effektoren. Spezielle Kits für Arf1-, Arf6-, Cdc42-, Rac1-, RalA-, Rap1-, Ras- und Rho-GTPasen sind erhältlich. Die entsprechende Bindedomäne des nachgeschalteten Effektors für jede kleine GTPase wird als GST-Fusionsprotein ausgedrückt. Bei der Immobilisierung auf Resin wird dieses Fusionsprotein dazu verwendet, die aktive (d. h. GTP-gebundene) GTPase herunterzuziehen. Der Schritt der Pull-Down-Affinitätsreinigung ist einfach und komfortabel mittels Zentrifugensäulen einer Mikrozentrifuge durchzuführen. Nach einem einfachen Waschschritt wird die gebundene GTPase wiedergewonnen, indem das GST-Fusionsprotein mittels eines SDS-PAGE-Probenbeladungspuffers aus dem Glutathionresin eluiert wird. Die gereinigte GTPase wird anschließend durch Western Blot unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers nachgewiesen, der im Lieferumfang jedes Kits enthalten ist.

Jedes GTPase-Kit enthält GST-Fusionsproteine der speziellen Bindedomäne, GTPγS- und GDP-Aktivatoren, Glutathion-Agarose-Resin, Lyse-/Binde-/Waschpuffer, primäre Antikörper, 2 x SDS-Probenpuffer, Zentrifugensäulen und Sammelröhrchen. Jedes Kit enthält ausreichend Komponenten für 30 Pull-Down-Assays. Die Kits sind für den Western-Blot-Nachweis mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper (Art.-Nr. 31460, Kaninchen; Art.-Nr. 31430, Maus) mit Thermo Scientific SuperSignal™ West Pico Chemilumineszenz-Substrat (Art.-Nr 34080) optimiert.

Besondere Merkmale:

• Hohe Sensitivität und Genauigkeit – optimierte Reagenzien, spezifische Antikörper und Western-Blot-Verfahren gewährleisten genaue Kontrollen und quantitative Ergebnisse

• Praktisch– keine Notwendigkeit, eigene GST-PBD- oder -RBD-Fusionsproteine zu exprimieren und zu reinigen oder teure Antikörper-basierte Immunpräzipitations-Affinitätsharze zu verwenden

• Schnelligkeit– gleichzeitige Inkubation des Zelllysats mit GST-PBD oder -RBD und dem Glutathionharz direkt in einer leistungsstarken Spin-Säule für Mikrozentrifugen

• Anwenderfreundlichkeit – Reagenzien und Pulldown-Bedingungen wurden für den sofortigen Erfolg optimiert, selbst für Erstbenutzer

• Effizienz – die Spin-Säulen und Sammelröhrchen für Mikrozentrifugen ermöglichen eine effiziente Trennung von Flüssigkeit und Harz und verhindern so Probenverluste

• Vollständig – die Kits enthalten Reagenzien für die Affinitätsreinigung sowie Kontrollen, einen kompatiblen Zelllysepuffer und spezifische Primärantikörper für den abschließenden Nachweis mittels Western Blot

GST-Fusionsproteine aktiver GTPase-Bindungsdomänen:

• Raf1-Ras-Bindungsdomäne (Raf1-RBD) bindet aktives Ras
• Pak1-p21-Bindungsdomäne (Pak1-PBD) bindet aktives Rac1 und Cdc42
• Rhotekin-Rho-Bindungsdomäne (Rhotekin-RBD) bindet aktives Rho
• RalGDS-Rap1-Bindungsdomäne (RalGDS-RBD) bindet aktives Rap1
• GGA3-Proteinbindungsdomäne (GGA3-PBD) bindet aktives Arf1 und Arf6
• Ral-bindendes Protein 1 (RalBP1) bindet aktives RalA

Enthält:

GST-Fusionsprotein einer spezifischen Bindedomäne, Glutathion-Agarose-Harz, GTPγS und GDP (100 x), Lyse-/Binde-/Waschpuffer, GTPase-spezifischer primärer Antikörper, SDS-PAGE-Probenbeladungspuffer (2 x), Spin-Säulen und Sammelröhrchen